实验20纸层析法分析氨基酸_基础生物学实验(安徽大学研究生复试用,生物生命科学)

2022-12-20 06:28:15 文档大全网 [ 字体：小中大 ] [ 阅读： ]

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实验二十纸层析法分析氨基酸

一、实验目的

1.掌握纸上层析的一般原理和操作方法。 2.了解氨基酸的特征性颜色反应。 3.学会分析未知样品的氨基酸成分。

二、实验原理

纸上层析法是分配层析法中的一种，常以滤纸为惰性支持物。纸上层析法是分离、鉴定和定量测定氨基酸、糖类、抗生素等有机物质的一项重要而简便的分析方法。所用设备简单、操作方便，使用样品少，分离效果好，为近代生物化学分析中重要技术之一。此法广泛地应用于科研和生产分析工作中。纸上层析的原理，常以水和有机溶剂作为展层剂；水和有机溶剂互溶后形成两个相：一个是饱和了有机溶剂后的水相，一个是饱和了水后的有机溶剂相。由于滤纸纤维素上的羟基和水分子有较大的亲和力，而与有机溶剂的亲和力相对较弱，因此我们认为水相为固定相，有机溶剂相为移动相。由于物质的极性大小不同，在两相中分配比例有所差异。极性小的物质在有机相中分配较多，随有机相移动较快；而极性大的物质在水相中分配较多，移动相对较慢，从而将极性不同的物质分开。一般来说，在相同的条件下，每种物质都有其固定的Rf值。Rf值的定义为：Rf=(原点到层析斑点中心的距离)/（原点到溶剂前沿的距离）

影响Rf值的因素有：①物质本身的化学结构；②展层所用溶剂系统；③展层剂pH值；④展层时的温度；⑤展层所用滤纸；⑥展层的方向(横向，上行或下行)。

用纸层析鉴定样品时，一般都与标准品相比较。若没有标准品，可选择文献记载的该物质层析条件，根据文献Rf值进行鉴定。

三、实验用品 1．材料氨基酸

2．器材层析缸、烘箱、冷热电吹风机、毛细管、针和线、培养皿。 3．试剂

(1)展层剂和平衡液

正丁醇：冰醋酸：水=4：1：5，充分摇匀，用分液漏斗取上层液作展层剂；下层液作平衡液。 (2)样品液

用水配成每ml含有苯丙氨酸、丙氨酸、组氨酸、脯氨酸各4 mg的4种氨基酸溶液，以及上述4种氨基酸的混合液(各4 mg／m1)。苯丙氨酸不易溶解于水，应稍微加热使之溶解。 (3)茚三酮

按展层剂O.25％的比例将茚三酮加入展层剂中，使其溶解。

四、实验操作

1．纸的处理

取25 cm长、15 cm宽的滤纸一张，离底边2 cm处用铅笔轻轻划一条与底边平行的线，并等距离的在线上定点样点(原点)划圈，使圈的直径小于0.5 cm。 2．点样

在每个圈下用铅笔记上每种氨基的代号（混合样可写M），然后用毛细管吸取样品，轻轻地点到相应的氨基酸圈内，待晾干或用冷风吹干后再点2次。每个样品共点3次。 3．饱和

将点好样的滤纸纵向卷起来，点样面向里，点样点位于一端，用针线缝成筒状，不要使滤纸两边接触(见图20-1)，然后将滤纸直立于层析缸中。在层析缸内培养皿中预先放入平衡液。滤纸筒放在培养皿周围饱和1小时。 4．层析

图20-1滤纸的缝合

将培养皿中放入2／3量的展层剂，转移到另一层析缸中。把饱和过的滤纸筒转移到此培养皿内，样品端向下垂直放置，切勿使展层剂浸到样品点。当溶剂前沿到达离上端3cm处，取出滤纸，用铅笔描出溶剂前沿，晾干。 5．显色

将晾干滤纸放入烘箱中(105℃)，烤几分钟后，滤纸上即显出氨基酸斑点。用铅笔描出斑点轮廓(见图20-2) 6. 结果处理

用尺量出原点到斑点中心距离以及原点到溶剂前沿距离，计算各标准氨基酸和混合氨基酸的Rf值。

图20-2层析谱

． 1．原点；2．层析点；3．溶剂前沿

六、实验建议

(1)在整个操作过程中，手只能接触滤纸边缘，否则手指上氨基酸会造成滤