微生物常用生化实验

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微生物常用生化实验



胆汁-七叶苷试验

原理：培养基中的胆汁对某些细菌有抑制作用，只有既能在胆汁中生长，又能水解七叶苷的细菌才能表现出对七叶苷的水解活性。肠球菌和D群链球菌都能在含有胆汁的培养基中生长并水解七叶苷，生成七叶素，七叶素与培养基中枸橼酸铁的Fe3+反应形成黑色沉淀，使培养基变黑。

65g/L NaCl生长试验

原理：肠球菌具有很强的耐盐能力，能在上述培养基生长，并且分解培养基中的葡萄糖产酸，使指示剂溴甲酚紫变黄。而链球菌的耐盐能力较弱，在此培养基不能生长。

原理：培养基中葡萄糖和乳糖的比例为1︰10，指示剂为酚红，酚红变色范围在pH6.4~8.2（黄~红），而KIA的pH为7.4，产少量的酸就可导致颜色改变。斜面部分为有氧环境，底层与空气隔绝是相对厌氧的环境。如接种的是能发酵葡萄糖和乳糖的细菌，因产生大量的酸，使斜面与底层均成黄色。如接种的是只发酵葡萄糖不发酵乳糖的细菌，培养基内仅有0.1%葡萄糖可产酸。开始的8~12h时，产生的酸足以引起斜面和底层的颜色变黄。在接下来的时间里，葡萄糖被完全消耗，斜面部分所生成的酸可因接触空气而氧化挥发，细菌在有氧的条件下开始分解蛋白质，氧化降解氨基酸，产生碱性化合物，18~24h整个斜面又转换成碱性颜色—红色。底层（相对缺氧状态），细菌发酵葡萄糖所生成的酸类物质不被氧化而氨基酸降解产生的碱性化合物不足以中和形成的酸，所以培养基仍为黄色。细菌如分解蛋白质产生硫化氢，则与培养基中枸橼酸铁形成黑色的硫化铁。细菌产气时，在底层还可看到有气泡或裂口现象。

苯丙氨酸脱氨酶试验

培养基：苯丙氨酸微量液体培养基

2）原理：细菌分解氨基酸可通过脱氨或脱羧基生成反应物。某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸脱去氨基生成苯丙酮酸，与10%三氯化铁试剂产生深绿色反应。 3）方法：待检菌用接种针以无菌操作接种于上述培养基中，35 ℃培养18~24h，滴加入10%三氯化铁试剂3-4滴。

4）结果：立即（延长时间颜色会退去）观察结果，出现绿色环者为阳性，阴性为黄色。 5）应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。在肠杆菌科细菌中变形杆菌属、普罗维登斯菌属、摩根菌属均为阳性，其它肠杆菌科细菌为阴性



氨基酸脱羧酶试验

原理：细菌凭借其特异脱羧酶作用于相应氨基酸的羧基，以产生胺类物质和二氧化碳的反应过程。脱羧作用的结果使pH移向碱侧，使指示剂溴甲酚紫变紫。脱羧的过程是在厌氧环境进行的，故接种完后培养基需封液体石蜡。

3）方法：待检菌用接种针以无菌操作接种于氨基酸脱羧酶和氨基酸对照培养基中，并加入无菌液体石蜡数滴于35 ℃培养18~24h，观察结果。

【结果】对照管应呈黄色，测定管呈紫色为阳性；对照管呈黄色，测定管也呈黄色为阴性。若对照管呈紫色则试验无意义，不能作出判断。 【应用】主要用于肠杆菌科细菌的鉴定




葡萄糖酸盐试验

1）培养基：葡萄糖酸盐微量液体培养基

2）原理：某些细菌利用培养基中葡萄糖酸盐作为惟一碳源，将葡萄糖酸钾（钠）分解成α-酮基葡萄糖，α-酮基葡萄糖是一种还原性物质，可与班氏试剂（硫酸铜）起反应，出现棕色或砖红色的氧化亚铜沉淀。

3）方法：待检菌接种于上述培养基中，35 ℃培养18~24h后，往培养基中，加入等量班氏试剂（硫酸铜）约10滴，于沸水中水浴10分钟。 4）结果：产生黄-橙色沉淀为阳性，蓝色为阴性。 5）应用：肠杆菌科属间的鉴别。肺炎克雷伯（+）， 大肠埃希菌（-）



特殊试验：拉丝试验

【原理】由于革兰阴性杆菌细胞壁肽聚糖层数少，较薄，易被4%的KOH破坏，释放出DNA，从而使DNA被拉成细丝状物。 【试剂】4%的KOH。

【方法】取4%的KOH和盐水各一滴，分别置于一张洁净玻片两端，用接种环挑去被检菌分别与4%的KOH和盐水研磨，同时向上拉细菌。 【结果】可见细丝状物被拉起者为阳性。

【应用】革兰阴性杆菌和革兰阳性杆菌的鉴别。

3、DNA酶试验

1）培养基：DNA酶微量液体培养基·。

2）原理：DNA与甲基绿结合形成绿色化合物。细菌如果产生DNA酶，可使长链DNA水解成单核苷酸，从而使绿色的化合物颜色变浅，根据细菌分解DNA能力的大小不同，颜色的变化可由深绿至浅绿（无色）。

3）方法：待检菌接种于上述培养基中，35 ℃培养18~24h。

4）结果：与未接种细菌的DNA酶微量管作对照，凡是颜色较之原培养基管变浅者都算为阳性。

5）应用：用于细菌的鉴别。金黄色葡萄球菌（+）。沙雷菌（+）。 硝酸盐还原试验

1）培养基：硝酸盐微量液体培养基

2）原理：某些细菌可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨和氮等。如亚硝酸盐与醋酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸（甲液）作用，成为偶氮苯磺酸，后者再与α-萘胺（乙液）结合为红色的N- α-萘胺偶氮苯磺酸。

3）方法：待检菌接种于上述培养基中，35 ℃培养18~24h后，将甲、乙液等量混合后加入培养基内，立刻观察结果甲液（对氨基苯磺酸0.8g+5mol/L醋酸100ml）；乙液（α-萘胺0.5g+5mol/L醋酸100mlml）。

4）结果：阳性者立刻或数秒内显红色；阴性可能①细菌不能将硝酸盐还原为亚硝酸盐（真正的阴性）②细菌可将硝酸盐还原为氨和氮等（假阴性）。区别两者：向原来的阴性试管中加入锌粉，锌离子能还原硝酸盐为亚硝酸盐，与试剂作用显红色，若是红色说明有硝酸盐的存在属第一种情况。

5）应用：本试验在细菌鉴定中广泛应用。大肠埃希菌

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