总RNA的提取原理

2024-02-20 10:04:34   文档大全网     [ 字体: ] [ 阅读: ]

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1.原理及方法(异硫氰酸胍--氯仿一步法)

TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质。 RNA降解

新鲜细胞:如果试剂没有问题,且外源性污染也可以排除,那么降解几乎都来自裂解液的用量不足。如 果将裂解液直接加入培养皿中裂解细胞,一定要使裂解液能覆盖住细胞。

2. 新鲜组织:某些富含内源核酸酶的样品(如肝脏,胸腺等),即使使用电动匀浆器匀浆也不能避免RNA的降解。更可靠的方法是:在液氮条件下将组织研碎,并且匀浆时使用更多裂解液。 3. 冷冻样品:样品取材后应立即臵于液氮中速冻,然后移至-70℃冰箱保存。样品决不能未经液氮速冻而直接保存于-70℃冰箱中。冷冻样品,即使是冷冻细胞,如果不在液氮条件下研磨碎,而直接加入裂解液中匀浆,RNA也比新鲜样品更容易降解。样品在与裂解液充分接触前决不能出现融化,所以研磨用具必须预冷,在碾磨过程中要及时补充液氮。样品研碎后,在液氮刚刚挥发完时,将样品迅速转移到含裂解液的容器中,立即混匀匀浆。

4. 外源RNA酶的污染:试剂,器械及实验环境中的RNA酶进入实验系统。

5. 内源RNA酶的污染:抑制剂失效或者用量不够,实验样品过多;匀浆时温度过高。 QOD260/OD280比值偏低 A

1. 蛋白质污染:确保不要吸入中间层及有机相。减少起始样品量,确保裂解完全、彻底。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。如果所得RNAOD260/OD280比值偏低,则用氯仿重新抽提一次,再沉淀,溶解。

2.苯酚残留:确保不要吸入中间层及有机相。加入氯仿后首先要充分混匀,并且离心分层的离心力和时间要足够。

3.多糖或多酚的残留:一些特殊的组织和植物中,多糖、多酚含量较多,这些残留也会导致OD260/OD280比值偏低。因此,从这类材料中提取RNA时,需要注意多糖、多酚杂质的去除。 4.设备限制:测定OD260OD280数值时,要使OD260读数在0.1-0.5之间。此范围线性最好。用水稀释样品:测OD值时,对照及样品稀释液请使用10mM TrispH7.5。用水作为稀释液将导致比值偏低。

QRNA提取得率低 A

1. 该组织或者细胞中RNA含量偏低:不同细胞和组织中RNA的丰度不同,如肝脏,胰腺,心脏等是高丰度组织(RNA含量2-4μg/mg),脑,胚胎,肾脏,肺,胸腺,卵巢等是中丰度组(RNA含量0.05-2μg/mg),膀胱,骨,脂肪等是低丰度组织(RNA含量<0.05μg/mg) 2. 组织起始量太少或者太多:样品量过少,则细胞组织中RNA含量较低;样品量过多则可能超过裂解液的裂解能力,裂解将不完全,从而导致RNA得率低。


核糖体RNA(ribosomal RNArRNA)是组成核糖体的主要成分。核糖体是合成蛋白质的工厂。在大肠杆菌中,rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%,而tRNA15%mRNA仅占3-5%

rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起,形成核糖体ribosome如果把rRNA从核糖体上除掉,核糖体的结构就会发生塌陷。原核生物的核糖体所含的rRNA5S16S23S三种。S为沉降系数(sedimentation coefficient),当用超速离心测定一个粒子的沉淀速度时,此速度与粒子的大小直径成比例。5S含有120个核苷酸,16S含有1540个核苷酸,23S含有2900个核苷酸。而真核生物有4rRNA,它们分子大小分别是5S5.8S18S28S,分别具有大约120160 19004700个核苷酸。

RNA样品电泳后,可见28S18S5S小分子RNA条带,则说明完整性好。若有降解可能是操作不当或污染了RNase.28S18S RNA比值约为21,表明RNA无降解。如比值逆转,则表明RNA降解。




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