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免疫原性检测方案
1. 结合抗体的检测（elisa法）
1.1 分别采用E2HSA、HSA、E4（可用多聚赖氨酸包被或者E4偶联蛋白包被），
1.2碳化二亚胺法制备E4-OVA或者E4-KLH偶联物：参考如下（拟委托别人做）：
1.2 抗原包被：取各抗原2μg/ml，100μl/ml包被过夜
1.3 封闭： 考虑E2HSA抗体血清中的HSA抗原与BSA抗原的交叉反应，所以采用5%脱脂奶粉溶液作为封闭液。孵育1h。
1.4 加入抗血清：加入不同稀释度的抗血清或者空白血清，并用HSA抗体和E4抗体作为对照，孵育2小时。
1.5 加入酶标二抗：加入相应种属的酶标二抗，孵育1h。 1.6 显色：TMB显色液显色
1.7 结果判断：以相应空白血清OD值的2.1作为是否有抗体的依据。 二、中和抗体的设定 1. 实验原理
采用RIN-m5F细胞株/cAMP测定法测定中和抗体，本品的活性部位为exenatide部位，对具有GLP-1受体的细胞有激动作用，使胞内
cAMP含量增加。用cAMP试剂盒测定胞内cAMP，可以反应药物的活
性情况，将抗血清与药物孵育后再刺激RIN-m5F细胞株，可以反应抗血清的生成情况，中和抗体越多，药物活性越低。 2. 实验步骤
2.1 抗血清的补体灭活。（或者采用抗体纯化的方法）
考虑到血清中含有的成分比较复杂，参考细胞培养时血清补体灭活的方法，将细胞在60℃加热30min，
抗体纯化可采用抗体亲和柱（PROTEIN A FF柱）进行纯化，并检测抗体纯度。 2.2 中和抗体的检测
根据活性测定的结果，选择50μg/ml作为抗体检测的药物浓度。取100μl的50μg/ml的E2HSA，加入100μl不同稀释度的抗血清或者对照血清（灭活血清或者纯化的抗体）孵育1h，后刺激细胞反应，并与标准品做比较。如活性明显降低，说明含有中和抗体。
另外，也可以建立exendin-4的活性检测，并如上检测，排除是否是HAS抗体的影响。
本文来源：https://www.wddqxz.cn/47db798d2dc58bd63186bceb19e8b8f67c1cefaa.html
2023-09-22
