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生物化学综合性实验
蛋白质的提取〔沉淀法〕和定量分析之
鸡蛋中卵清蛋白的提取和定量测定
一、实验目的
研究盐析沉淀和等电点沉淀法的根本原理和技术。 一、 二、实验原理
1、沉淀法粗别离蛋白质⑴[2]
沉淀法是别离纯化生物大分子物质常用的一种经典方法，可分盐析法、等电点沉淀 法和有机溶剂沉淀法等。
蛋白质分子外表含有带电荷的基团，这些基团与水分子有较大的亲和力，故蛋白质 在水溶液中能形成水化膜，增加了蛋白质水溶液和稳定性。如果在蛋白质溶液中参加大 量中性盐，导致蛋白质分子外表电荷被中和，水化膜被破坏，最终引起蛋白质分子间相 互聚集并从溶液中析出，这就是盐析作用。
由于各种蛋白质分子外表的极性基团所带电荷数目不同， 它们在蛋白质外表上的分 布情况也不一样，因此，将不同蛋白质盐析出来所需要的盐浓度也各异，盐析法就是通 过控制盐的浓度，使蛋白质混合液中的各个成分分步盐析出来，达到粗别离蛋白质的目 的。
盐析法是1878年Hammarster首次使用的，可用作盐析的中性盐有过硫酸钠、氯化 钠、磷酸钠、硫酸铵等，其中应用最广的是硫酸铵，硫酸铵在水中溶解度大， 25 C可达 的浓度，化学性质稳定，溶解度的温度系数变化较小，价廉易得；分段效果较其他盐好， 性质温和，即使浓度很高时也不会影响蛋白质的生物学活性。
鸡蛋清的主要成分是球蛋白和白蛋白〔卵清蛋白〕，球蛋白可在半饱和硫酸铵溶液中析 出，而清蛋白如此在饱和硫酸铵溶液中才能析出。
蛋白质的盐析作用是可逆过程，由盐析获得的蛋白质沉淀，当降低其盐类浓度时， 又能再溶解，因而可初步纯化蛋白质。
等电点沉淀法是利用蛋白质在其等电点时溶解度最小来别离具有不同等电点蛋白 质的方法。蛋白质是两性电解质，蛋白质分子的电荷性质和数量因 PH不同而变化，蛋 白质处于等电点时，其净电荷为零，由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集 沉淀，因此，在其他条件一样时，它的溶解度达到最低点。
卵清蛋白的等电点为4.6-4.8 ,。
2、蛋白质的测定
根据蛋白质的物理化学性质，测定蛋白质的方法有凯氏定氮法、紫外吸收法、Folin- 酚法、考马斯亮蓝G-250染色法等。
由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键， 因此蛋白质具有吸收 紫外线的性质，吸收顶峰在 280nm波长处。在此波长X围内，蛋白质溶液的光吸收值 〔A280〕与其含量呈正比关系，可用作定量测定。
由于核酸在280波长处也有光吸收，对蛋白质的测定有干扰作用，但核酸的最大吸 收峰在260nm处，如同时测定260nm的光吸收，通过计算可能消除其对蛋白质测定的影 响，因此溶液中存在核酸时必须同时测定 280nm与260nm之光密度，方可通过计算测得
离心15min
溶液中的蛋白质浓度。
利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类 不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中〔特别是在柱色谱别离中〕广泛应用。 此法的缺点是〔1〕对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白 质，有一定的误差；〔2〕假如样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大 的干扰。
三、材料、试剂与器具 1、材料 新鲜鸡蛋
2、 试剂
饱和硫酸铵、硫酸铵结晶、生理盐水、1mg/mL标准牛血清白蛋白液
3、 器具
TU180紫外分光光度计、离心机、恒温水浴锅、冰箱、电子天平 四、实验步骤[2][3]
〔一〕、鸡蛋清清蛋白的提取
5mL鸡蛋清〔20C〕 5mL生理盐水〔20C〕 稀
饱和硫酸铵溶液
边加边搅拌，饱和度为50%
离心15min
释液〔以减少共沉淀〕 10mL生理盐水〔
逐滴参 20..- 溶解
用0.1mol/L醋酸调pH=4.6-4.8〔卵清蛋白等电点〕 静置10mi n
3000r/min 离心 15min .. 一
5mL生理盐水〔20C〕
弃上清液 J 沉淀〔卵清蛋白晶体〕
溶解〔粗产品于20C以下保存〕
〔二〕紫外吸收法测定卵清蛋白的含量 ⑴
1、标准曲线法
〔1〕标准曲线的绘制
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2023-09-16
