拟南芥蘸花法

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农杆菌蘸花转化拟南芥法

1、 将低温保存的带有表达载体的农杆菌菌株，分别在对应抗性平板上划线，挑取单菌落接

种于5ml的已加入对应抗生素的液体LB培养基中，28℃下250rpm振荡培养18-24h； 2、 然后相同条件下按照1:100接种扩大培养，总菌液体积为200ml，直到OD600值在0.8-1.0

范围内；

3、 离心沉淀并去上清液，用等体积的5%的蔗糖溶液重悬菌体，在菌液中加入0.02%-0.04%

的SilwetL-77混匀；

4、 将拟南芥的花序在菌液中蘸取0.5-1min即可(在转化前要先将拟南芥的角果剪掉); 5、 然后将拟南芥苗放置于黑暗，湿润的条件下16h，一周后，重复侵染一次； 6、 收种后种植后代，向12d的幼苗上喷洒54mg/ml除草剂或在将种子播种于抗性MS平板

上以筛选阳性植株。

拟南芥播种

1、 将拟南芥种子用50%的84消毒液表面消毒6-8 min，继而用无菌水漂洗3次;

2、 在0.1%琼脂糖中悬浮，然后播种在抗性的MS培养基上，4ºC低温避光处理2天后，转

入光照培养室生长。

3、 幼苗7d左右便可筛到阳性植株，并移栽到含有蛭石的营养土中继续生长（蛭石：营养

土=1：3）。植株种植的培养箱维持22℃恒温和16h光照/8h黑暗培养的循环培养条件。

注：几种常用抗生素的工作液浓度

Kanamycin 50μg/ml Gentamicin 50μg/ml Rifampicin 25-50μg/ml Hygromycin 50μg/ml Barstar 25-50μg/ml

注：MS培养基配方（1L） MS盐 4.4g MES 0.5g 蔗糖 10g 调PH至5.8-6.0 加Agar 10g

(在抗性MS培养基上筛选阳性转基因植株时可不加蔗糖防止长菌)

42. Schägger H, von Jagow G (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa.Anal Biochem166:368–379.

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