辛甜翻译

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毛细管电泳法分析酶化葡萄糖基黄酮类化合物

辛 甜

摘要 ：HPCE紫外检测被用于分析葡萄糖基黄酮类酶化物，在日本常用作天然食品添加剂。 分析了以黄酮醇或黄酮作为配质的四项。 每一项都是以各种长度的麦芽低聚糖链组成的一种苷类混合物。在碱性条件下，具有未经处理的熔融石英毛细管的毛细管区带电泳，苷类的糖链越长迁移速度越快。用硼酸盐缓冲剂(PH10.0)可区别带有1-13个葡萄糖单位的黄酮醇苷。黄酮苷比黄酮醇苷需要更高的PH值才可达到好的分离。 关键词：缓冲剂组成，黄酮类化合物，配质，苷类

1． 引言

天然来源的黄酮类化合物有各种各样的化学与生物活性，因此有望成为天然的食品添加剂。 然而，他们却受限与其低水溶性。由环糊精葡萄糖基转移酶进行修饰，修饰酶黄酮类化合物改良了其水溶性[1-3]。几个项目在日本被批准使用作为天然食品添加剂。他们中的每一个都是一种以同样非糖部和各种各样的长度麦芽低聚糖链子组成的苷混合物。其组成部分的结构和命名见图1。根据其制造过程，这些苷的大小和各自内容应该是不同的。要评估单独项目的质量，必须弄清它的化学成分。 我们由高效液相色谱(HPLC)报告了对EM五羟黄酮苷的分析，但有些组成部分不可能完全被分离[4]。

高效毛细管电泳法(HPCE) 应用到黄酮类化合物的苷的分离的由几位作者报告。 其中一些报告涉及了含有同样份额的糖部与非糖部的苷[5-7]，也运用HPLC研究了衍生化的麦芽低聚糖 [8,9]。在这两种情况下，运用CZE都可达到相当好的分离。由此，预计有黄酮类化合物的非糖部和麦芽低聚糖链子组成的EM黄酮类化合物也可由CZE进行分离。因此，在这项研究中的四个项目，即EM芸香苷、EM异槲皮苷、EM橘皮苷和EM柚苷(图1)，可被CZE紫外检测进行分析。在碱性条件下，具有未经处理的熔融石英毛细管的CZE对组成部分进行处理。优化了每个项目的分析条件。 2．实验 （2.1）仪器

使用带有黄金软件系统的AP/ACE5500系统(贝克曼， 富勒坦，加州，美国)。在允许液体冷却的弹药筒安置了未经处理的熔融石英毛细管57 cm (检测窗口在50 cm)×375毫米I.D. (贝克曼)。制备毛细管通过每5分钟用0.1 M HCl和0.1 M NaOH交替冲柱两次,再用水冲洗1分钟，然后用缓冲溶液冲洗1分钟。在分析样品时，毛细管连续地用0.1 M NaOH (5分钟)，水(1分钟)和缓冲溶液(1分钟)冲洗。使用压力注射(0.5 p.s.i.) 5秒。(1 p.s.i.=56894.76 Pa) HPCE在25℃运行，紫外探测器（贝克曼) 在254nm处检测出苷类。 （2.2）样品与试剂

日本食品添加剂协会通过商业化得到了EM芸香苷、EM 异槲皮苷、EM橘皮苷和EM柚苷。 他们分别以4，2，10和10mg/ml的浓度溶于水。 所有化学制品均为等级试剂。在实验中使用超纯水(＞18 MΩ cm)通过Milli-Q SP试剂供水系统制备(微孔，贝得福得，麻省，美国)。

连续缓冲是0.02， 0.04或0.1 M H3 BO3 - NaOH (PH8.5， 9.0， 9.5或10.0)， 50mMNa 2HPO4 - NaOH (PH12.0)或30mMNaB4O7-50mM NaH2 PO4 (PH10.5)。每次连续缓冲，PH值需要用1 M NaOH校正。 3．结果与讨论

3.1 H3 BO3 - NaOH 缓冲剂

EM黄酮类化合物通过使用未经处理的熔融石英毛细管和硼酸盐缓冲液CZE进行分析。


图2个显示了EM芸香苷和EM 异槲皮苷的结果。苷类糖链越长迁移越快。这表示每个五羟黄酮苷都被分离成一个单独带电阴离子，这也许导致了B环上硼酸盐复合体的形成(图3) [6]. 这些阴离子被吸引到阳极，即便由于巨大的电渗流程他们被迫向负极迁移。由于带有越长糖链的苷有更小的充电或估量比率因此有越低的电泳流动性，可以使迁移时间缩短。

EM芸香苷在不同的PH(8.5-10.5)和不同硼酸盐浓度(0.02-0.1 M)条件下测试。高PH值和高浓度得到更好的结果(图4)。在最佳条件，即0.1 M硼酸盐和PH10.0，每一RGns (n＜13)的相邻峰都被完全分离 (图2)。

与EM芸香苷在pH10.0的电泳图谱比较，EM橘皮苷和EM柚苷CZE显示了相似的电泳图谱。糖链越长的苷有着越高的迁移率。 然而，在越低的pH值这些黄酮苷得到的结果越不好。 这表明了氢核从黄酮苷的酚醛羟基发生电离。 3.2 Na 2HPO4-NaOH缓冲剂

在更高的PH值的条件下,EM橘皮苷和EM柚苷用Na 2HPO4 - NaOH缓冲剂分析。EM橘皮苷的主要组成部分橘皮苷和HGns (n＜10)，可用50mM缓冲剂在PH12.0 条件下使相邻峰达到分离(图5A)。 另一方面，由于柚苷和NG1不能彼此分离，EM柚苷的化学成分不能在这些情况下被分析。(图5B)

3. 3 Na2B4O7-NaH2PO4缓冲剂

EM柚苷也用非络合磷酸盐硼酸盐缓冲进行分析。使用30mMNa2B4O7-50mM NaH2 PO 4缓冲剂(PH10.5)，柚苷峰顶与NG 1峰达到完全分离 (图6). 然而，在这些条件下，尽管NG1有更大的分子大量，NG1却比柚苷的迁移速度慢，其原因未知。 4．结论

CZE分析了具有不同麦芽低聚糖链的四种EM黄酮类化合物的组成部分，结果优于用HPLC分析。每个样品的最佳分析条件是：EM芸香苷、EM异槲皮苷0.1 MH3 BO3 - NaOH（PH10.0），EM橘皮苷50mMNa 2HPO4 – NaOH缓冲剂（PH12.0），EM柚苷30mMNa2B4O7-50mM NaH2 PO 4缓冲剂(PH10.5)。 为申请CZE用于其他酶化葡萄糖基食品添加剂还将进行进一步研究。

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