植物叶绿体色素含量的测定

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实验四 植物叶绿体色素含量的测定

高等植物光合作用过程中利用的光能是通过叶绿体色素吸收的。叶绿体色素含量与光合作用密切相关，是反应叶片生理状态的重要指标。在植物光和生理、发育生理和抗性生理研究中经常需要测定叶绿素含量。叶绿素含量也是知道作物栽培生产和选育作物品种的重要指标。

一、原理：

根据叶绿体色素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公事计算出提取液中个色素的含量。根据朗博—比尔定律，某有色溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A=aCL。式中：a为比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，a为该物质的吸光系数。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合溶液在某一波长下的吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿体a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。

二、植物材料、仪器设备及试剂配制：

（一）植物材料：完全液和缺素溶液培养的烟草苗叶片

（二）仪器设备：分光光度计、电子天平、剪刀1把、镊子一把、玻璃研钵2个、4个25mL具塞棕色容量瓶、漏斗2个、移液管若干只、吸球、洗瓶、玻璃棒、吸水纸、保鲜膜等。

（三）试剂配制：95%乙醇（分析纯）、石英砂和碳酸钙

三、实验步骤：

1.称取新鲜植物叶片，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。

2.称取剪碎的新鲜叶片0.2g，共4份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙及2mL95%乙醇，研成匀浆，在加入乙醇10mL，继续研磨至组织变白。静置3~5min。

3.取滤纸1张，置漏斗中，用95%乙醇湿润，沿玻璃棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25mL棕色容量瓶中，用少量95%乙醇冲洗钵体、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。

4.用滴管吸取95%乙醇，将滤纸上的叶绿体色素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿色为止。最后用95%乙醇定容至25mL，摇匀。把叶绿体色素提取液倒入光径1cm的比色杯内。以95%乙醇为空白，在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。

四、结果计算：

1、按一下公式求叶绿体色素浓度（mg/L） Ca=13.95A665-6.88A649 Cb=24.96A649-7.32A665

Ct=Ca+Cb=18.08A649-6.63A665

Cxc=（1000A470-2.05Ca-114.8Cb）/245

2、按一下公式计算各叶绿素含量 叶绿素含量（mg*g/鲜重）

=色素弄苏×提取液体积（mL）×稀释倍数/样品鲜重（g）×1000

五、注意事项：


1.研磨石要在弱光下进行，且速度要快 2.研磨时要加入少量的碳酸钙，保护叶绿素 3.残渣中的色素也要充分洗脱 4.比色液不能浑浊

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