无缝克隆,同源重组克隆

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1.1.1 G

ibsonassembly

简介（INTRODUCTION）

原理：Gibsonassembly是一种onestep,onepot的快速基因组装方法。它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60min就可以得到组装好的DNA。

装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA外切酶（T5exonuclease）,高

保真DNA聚合酶。（Phusionpolymerase）和耐热DNA连接酶（TaqDNAligase）的共同作用。首先，T5核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’.每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA单链为模板，沿3'方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。最后，连接酶将两条DNA单链黏合起来，密封裂缝。这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。下面是组装的示意图。

材料（MATERIALS）

 试剂（REAGENTS）

NAD，H2O，1MMgCl2，1MDTT，10mMdNTPmix，1MTris-HClpH7.5，50%PEG-8000，2.7mg/mLTagligase，0.85μg/mLT5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）  实验前准备（SETUP）

于冰水浴中配制如下反应体系。如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

4xisothermalassemblybuffer NAD20mg H2O300μL


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1MMgCl2300μL 1MDTT300μL 10mMdNTPmix600μL 1MTris-HClpH7.53mL 50%PEG-80003mL

加水到7.5mL，每管分500μL存于-20°C或-80°C冰箱,够3000个反应

2×assemblymix:bestcombination: 100reaction1mL 2.7mg/mLTagligase10μL 0.85μg/mLT5_ExO100μL Phusion(1×)25μL 4×G.A.buffer500μL

加水365μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。

实验步骤（PROCEDURE）

1. 设计引物通过PCR的方法在DNA片段的两端加上同源片段，NEB推荐同源片段的长度为

15-40bp，同时要求这部分对应的退火温度高于4°C。

2. 进行DNA纯化：PCR产物进行琼脂糖电泳，胶回收。或者PCR产物回收试剂盒回收。 3. 进行重组反应，以20μL反应体系为例：

组分加入量

IsothermalassemblyMasterMix10μL 线性化载体10-100ng(1-2μL) 插入片段8-9μL(3-5×载体) SterilizedddH2O补足至20μL

50°C反应15-60min

4. 反应产物转化、涂板及克隆鉴定同传统分子克隆方法。

针对性建议

1. 在选择克隆位点时，应避免选择克隆位点上下游50bp内有重复序列的区域。当克隆位点上

下游20bp区域内GC含量均在40%～60%范围之内时，重组效率将达到最大。如这部分区域GC含量高于70%或者低于30%，重组效率会受到较大影响。

2. Gibson组装克隆法缺点之一是适用与长度超过200bp的片段的组装；缺点之二是如果黏性

末端形成稳定的二级结构，如发夹结构或者茎环结构，那么成功率会大受影响。 3.

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