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苯、联苯、萘的高效液相色谱分析
一、实验目的
1、理解、掌握反相色谱的原理与优点。 2、了解高效液相色谱仪的组成与结构。 3、掌握归一化定量方法的特点和适用范围。
二、实验原理
色谱分析是以色谱分离为基础的一种分析方法。色谱分离的基本特点是具备两个相：不动的一相，称一为固定相；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称为流动相。当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从而按先后不同的次序从固定相中流出。
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、
灵敏度高、操作自动化的特点。高效液相色谱仪器结构如右图所示。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，这种色谱法称为反相色谱法。这种分离方式特别适合于同系物、苯并系物等。萘、联苯、菲与ODS 柱上固定相的作用力大小不等，它们在固定相与流动相中的分配比k'值不等，被流动相洗脱的速率不同，因而先后流出柱子。根据各组分的保留时间不同，可对其进行定性鉴别。根据组分峰面积大小就可求出各组分的含量。
色谱定量分析关键是求出定量校正因子。色谱定量分析是基于峰面积与组分的量成正比关系，而定量校正因子就相当与比例系数。但由于同一检测器对不同物质具有不同的响应值，即对不同物质，检测器的灵敏度不同，所以两个相等量的物质得不出相等峰面积。或者说，相同的峰面积并不意味着相等物质的量。因此，在计算时，对于不同的物质，需将峰面积乘上各自对应的比例系数，使组分的面积转换成相应物质的量，即
Wi = fi · Ai
式中Wi为组分i的量，它可以是质量，也可以是摩尔或体积（对气体）；Ai为峰面积，fi为换算系数，称为定量校正因子。
由于物质量Wi不易准确测量，要准确测定定量校正因子fi不易实现。而且由于不同仪器的差异，不同实验室测得的定量校正因子fi通常重现性不好。在实际工作中，以相对定量校正因子fi'代替定量校正因子fi。相对定量校正因子fi定义为：样品中各组分的定量校正因子与标准物的定量校正因子之比。用下式表示：
fi'(m)
fi(m)Asmi
fs(m)Aims
常用的定量计算方法有内标法、外标法和归一化法等。其中归一化法简便、迅速，较为
常用。归一化法的定量公式为：
xi
Aifi
100%
A1f1A2f2Anfn
式中，Xi为组分i的质量分数，Ai为组分的峰面积，fi'为组分的相对定量校正因子。定量校正因子可通过对标准样的测定而求得。采用归一化法的条件是：样品中所有组分都要流出色谱柱，并能给出信号。此法对进样量的要求不十分严格。
三、试剂和仪器
试剂：乙腈（A.R.），重蒸馏一次（或用色谱纯）；二次蒸馏水；苯、萘、联苯均为 A.R.
-1
级；苯标准溶液，400mg·L；萘标准溶液，40.0mg·L-1；联苯标准溶液，20.0mg·L-1。 待测样：不纯的苯试样，其中含有杂质萘和联苯。称取苯试样0.10g（精确至0.0001g），用乙醇溶解，定容至100 mL。 仪器：依利特P230型高效液相色谱仪；紫外吸收检测器； SinoChrom ODS-BP色谱柱，5μm，4.6mm×200mm；微量注射器，50μL；六通阀，50μL定量环。
四、实验过程
1、按要求比例配制流动相，用微孔滤膜过滤，然后超声震荡10min除去流动相中溶解的气体。
2、按仪器操作规程开机预热，并更换至所需流动相，设定仪器工作参数。 色谱条件如下 柱温：室温
流动相：90%甲醇水溶液（体积分数），流量1.2mL/min 紫外检测器工作波长：254nm
3、开启数据采集器，开启EC 2000色谱数据处理软件。查看基线，待基线平直后方可开始测定。
4、用微量注射器吸取10μL待测样注入定量环，进样。待各组分全部出峰后，记下各组分保留时间和峰面积。
5、按待测样同样的操作分别注入苯、萘、联苯的标准溶液，记录相应的保留时间和峰面积。 6、当所有样品测完后，换用纯甲醇冲洗20min，然后关闭色谱仪。
注意事项
1、为保护仪器色谱柱，柱压不可超过25MPa，当柱压达到20MPa时就应适当减小流速； 2、进样必须使用专用的平头注射器，绝对严禁使用尖头注射器； 3、进样前应排尽注射器中的气泡，不可将气泡注入色谱系统。
五、数据处理
1、根据保留时间的对比确定未知样中各色谱峰的归属。
2、根据标准溶液的浓度和峰面积求取各组分的相对定量校正因子。 3、求取样品中各组分的百分含量。
六、思考题
1、观察分离所得的色谱图，解释不同组分之间分离的原因。
2、高效液相色谱柱一般可在室温下进行分离，而气相色谱柱则必须恒温，为什么？高效液相色谱柱有时也控制柱温在高于室温的条件下进行测定，这又为什么？ 3、说明紫外吸收检测器的工作原理。
本文来源：https://www.wddqxz.cn/b4efbcd2998fcc22bdd10d00.html
2022-03-29
