酰基转移酶

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货号: QS2405-25 规格：25管/12样

酰基转移酶

（alcohol acyl transferase，AAT）活性测定试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AAT是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理：

AAT催化乙酰CoA转移乙酰基到丁醇，同时还原DTNB生成TNB；TNB在412nm有吸收峰，测定412 nm吸光度增加速率，来计算AAT活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计、1mL玻璃比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。 试剂组成和配制：

试剂一：液体×1瓶，4℃保存； 试剂二：液体×1瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存。临用前加蒸馏水1.3 mL充分溶解，4℃保存。 试剂四：液体×1支，4℃保存。 试剂五：粉剂×1瓶（棕色），4℃避光保存。临用前加入试剂二1.3 mL充分溶解，4℃避 光保存。 粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加

入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心20min，取上清，置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议

500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后16000g，4℃，离心20min，取上清置于冰上待测。 AAT测定操作：

1. 分光光度计预热30min以上，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂二在37℃水浴保温30 min以上。

3. 空白管：依次在1mL玻璃比色皿中依次加入100μL蒸馏水、700μL预热的试剂二、50μL试剂三、100μL试剂四和50μL试剂五，迅速混匀后于于412nm比色，记录10 s和130 s的吸光值，分别记为A1和A2。△A空=A2-A1。空白管只需做1个。

4. 测定管：依次在1mL玻璃比色皿中依次加入100μL上清液、700μL预热的试剂二、50μL试剂三、100μL试剂四和50μL试剂五，迅速混匀后于412nm比色，记录10 s和130 s的吸光值，分别记为A3和A4。△A测=A4-A3。如果△A测偏低，可以延长反应时间，如测定10 s和310 s的吸光度，相应修改计算公式中反应时间。 AAT活性计算：

（1）按照蛋白浓度计算

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活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。 AAT (U/mg prot) = 1000×（△A测—△A空）÷(Cpr×V样) ÷T= 5000×（△A测—△A空）÷Cpr Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；T：反应时间，2 min。 （2）按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。 AAT (U/g) = 1000×（△A测—△A空）÷(W×V样÷V样总) ÷T= 5000×（△A测—△A空）÷W W：样本质量，g；V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2 min。 （3）按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每104个细胞每分钟催化吸光值变化0.001个单位为1U。 AAT (U/104cell) = 1000×（△A测—△A空）÷(细胞数量×V样÷V样总) ÷T= 5000×（△A测－△A空）÷ 细胞数量

V样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；V样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，2 min。

注意事项：

上清液蛋白质含量需要另外测定。建议购买本公司生产的BCA蛋白质含量测定试剂盒。

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