电泳分离蛋白质

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电泳是一种分离蛋白质的常用手段。电泳中选择合适的缓冲系统十分重要。选择时主要考虑缓冲溶液的PH、离子种类和离子强度。一般分离酸性蛋白质的配制PH较大的缓冲溶液，分离碱性蛋白质的配制PH较小的缓冲溶液，而离子强度则尽可能小。试解释原因。 要点 缓冲溶液PH 缓冲溶液离子强度

电泳的基本原理

带电颗粒在电场作用下，向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis, EP)。利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术。

生物大分子如蛋白质,核酸,多糖等大多都有阳离子和阴离子基团,称为两性离子.常以颗粒分散在溶液中,它们的静电荷取决于介质的H+浓度或与其他大分子的相互作用.在电场中,带电颗粒向阴极或阳极迁移,迁移的方向取决于它们带电的符号,这种迁移现象即所谓电泳.

缓冲溶液的PH与蛋白质的等电点有关 等电点（PI）

蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液的酸碱度影响。当溶液的PH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋白质等电点。 某一蛋白质的pI大小是特定的,与该蛋白质结构有关，而与环境pH无关。在某一pH溶液中当pH＞pI时该蛋白质带负电荷。反之pH＜pI时该蛋白质带正电荷。pH=pI时该蛋白质不带电荷 。人体内pH=7.4；而体内大部分蛋白质的 pI＜6； 所以人体内大部分蛋白质带负电荷。 不同蛋白质各有特异的等电点。最常用的方法是测其溶解度最低时的溶液pH值。

蛋白质是两性电解质，在蛋白质溶液中存在下列平衡：



电泳介质的pH值

溶液的pH值决定带电物质的解离程度,也决定物质所带净电荷的多少.对蛋白质,氨基酸等类似两性电解质,pH值离等电点越远,粒子所带电荷越多,泳动速度越快,反之越慢.因此,当分离某一种混合物时,应选择一种能扩大各种蛋白质所带电荷量差别的pH值,以利于各种蛋白质的有效分离.为了保证电泳过程中溶液的pH值恒定,必须采用缓冲溶液.




离子强度

离子强度是表示溶液中电荷数量的一种量度。

离子强度等于溶液中各种离子的摩尔浓度与其价数平方之积总和的一半 I=1/2∑CiZi2 (I:离子强度;Ci:离子的摩尔浓度;Zi:离子价数. ) 通常溶液的离子强度在0.02～0.2之间 低离子强度时，迁移率快

但离子强度过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pH恒定 高离子强度时,迁移率慢

这是由于带电的生物大分子吸附溶液中的反电荷离子形成离子氛，犹如大气层包围地球。距离中心离子愈近，反离子密度愈大；反之，密度愈小。根据反离子与中心离子结合的紧密程度不同，可将反离子层分为吸附层和扩散层。在电场的作用下，吸附层的反离子随中心离子一起泳动。离子强度越大，吸附层反离子越多，泳动粒子团的净电荷越少，泳动速度也就越慢。 离子氛



因此为了获得更快的反应速度，在缓冲容量允许的范围内，离子强度应该尽可能小 蛋白质是由氨基酸组成的，而氨基酸分为碱性氨基酸和酸性氨基酸。 少数蛋白质含碱性氨基酸较多，其等电点偏于碱性，如鱼精蛋白、组蛋白等。

也有少量蛋白质含酸性氨基酸较多，其等电点偏于酸性，被称为酸性蛋白质，如胃蛋白酶和丝蛋白等。

所以最终蛋白质呈酸性还是碱性要看它含的哪种氨基酸多。

氨基酸本身就是两性物质，在酸中氨根基团解离成为阳离子，具体是氨根基团变为 -NH4+ ,具有了解离出H+的能力 (我们称这为酸的定义)

在碱中蛋白质解离成为阴离子,具体是氨根基团变为 -NH3不在作为供H体, 此时-COOH基团失去H+ 使得蛋白质分子整体现现为阴离子.

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