读书报告1

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硬骨鱼类的toll样受体:从基因组到功能

非特异性免疫是通过不同种系编码的模式识别受体（prr）识别入侵机体的外来分子，为机体提供直接、快速的免疫应答，在感染早期发挥重要作用。PRR分为膜结合受体TLR、可溶性受体C3、凝集素等。研究表明，先天免疫主要是由于toll样受体（TLR）识别病原体相关分子模式（PAMP）。PAMP是一种高度保守的微生物结构，包括细菌脂多糖（LPS）、肽聚糖（PGN）、鞭毛蛋白、非甲基化cpgdna、病毒双链RNA（dsRNA）和葡聚糖。TLR通过识别病原体相关分子模式（PAMP），触发促炎和耐药病原体的信号转导途径，最终消灭入侵的病原体。

tlrs是首次在果蝇中发现的一类细胞膜蛋白，参与果蝇胚胎发育时背腹极性的建立，随后又在人类和其他哺乳动物中发现了很多tlr家族蛋白。目前在人类中已经发现了10种tlr家族成员（tlr1-10），哺乳动物中已发现13种（tlr1-13），而在鱼类中现已发现至少19种（tlr1-5，5s，7-9，13-14，18-23，25-26）。tlr家族成员属ⅰ型跨膜受体蛋白，结构分为胞外区、跨膜区和胞质区。胞外区的n末端是一个富含亮氨酸的结构域（lrr），胞内区的c末端是一个toll/il-1受体结构域（tir）。lrr结构域负责识别配体，而tir结构域则负责募集接头分子，此外，tir结构域还与tlr在细胞内的定位有关。在哺乳动物中已发现的接头分子有：一种髓样分化蛋白myd88；mal（类myd88接头蛋白，tirap），trif（含tir结构域诱导产生tfn-β的接头蛋白）或ticam-1（含有tir结构域的接头分子1）；tram（trif相关接头分子）或ticam-2；sarm（sterileaandheat-armadillomotifs），这些接头分子结构上的共同点是都具有一个tir结构域。tlr通过募集结合不同的接头分子，激活nf-κb，irf等不同的转录因子，引起多种与免疫有关基因的转录与表达，分泌促炎性细胞因子包括白细胞介素（il），肿瘤坏死因子（tnf）和ⅰ型干扰素（ifn）分子等，从而对病原产生不同的免疫应答。除了tlr3，哺乳动物的tlr几乎全部依赖myd88信号转导通路。鱼类的tlr主要依赖myd88或trif信号转导通路，诱导转录因子nf-κb和干扰素调节因子的表达启动固有免疫和适应性免疫而抵御病原入侵。

在人类中已经发现了两个主要的TLR亚家族。Tlr1、2、4、5、6和10是细胞表面亚家族的成员，它们识别微生物油、糖和蛋白质组。TLR3、7、8和9对核苷酸敏感 应亚家族的成员，识别来自病毒或细菌的核苷酸衍生物。核苷酸tlrs定位在细胞内的很多隔间中。在小鼠中发现了3种人类基因组中丢失的tlr基因，tlr11、12和13，在这3种基因中，到目前为止只有tlr11的一种配体被确认。它的配体是来自于一种寄生虫的抑制蛋白，这表明tlr11也是一种细胞表面受体。

硬骨鱼被认为具有原始的免疫系统，与哺乳动物的先天和适应性防御机制相比，这具有重要的科学价值。它们代表了几乎一半的脊椎动物物种，因此形成了最大和最多样化的脊椎动物种群。鱼类TLR的主要特征和信号级联中的相关因素在结构上与哺乳动物TLR系


统高度相似。然而，鱼类的TLR也显示出非常不同的特征和巨大的多样性，这似乎来自它们多样性的进化历史和它们生活的非常不同的环境。

根据报道的已知全长预测的氨基酸序列的相似性比较和系统进化分析，在鱼类中鉴定出了8个主要的tlr分支。tlr2分支，包括tlr1、tlr2和tlr14；tlr3分支；tlr4b分支；tlr5分支，包括tlr5m和tlr5s；tlr7分支包括tlr7和tlr8；tlr9分支；tlr21分支包括tlr19、tlr20和tlr21；tlr22分支包括tlr22和tlr23。其中，tlr5s以及tlr21分支和tlr22分支在哺乳动物中并未发现，属于鱼类所特有的。

基因组和基因复制是硬骨鱼类进化史和基因组多样性的主要原因，但鱼类生物学家在研究中使用基因组学工具时往往忽视了这一问题。2R基因组复制假说认为原始脊椎动物基因组在5-8亿年前复制了两次，一次是在七鳃鳗谱系分化之前，一次是在七鳃鳗谱系分化之后。第二次四倍体似乎发生在脊椎动物亚门，与口腔的发生相一致。在一些基因家族中可以看到这些现象的证据。文昌鱼有一个Hox基因簇，而七鳃鳗有两个独立的基因簇。鸟类和哺乳动物等颚脊椎动物有3-4个独立的Hox基因簇，这证明它们经历了第二次四倍。 硬骨鱼类基因组的分析显示，hox基因簇以及很多其他的基因组位点以比哺乳动物更多的拷贝数出现，证明在硬骨鱼类的世系中有一次古老的全基因组的复制，发生在3.25-3.5亿年前，在肉鳍鱼类分化之后。例如，在斑马鱼和其他辐鳍鱼类中发现了7个hox基因簇，而在哺乳动物中只发现了四个。鱼类特有的基因组复制假说或者所谓的3r假说近年来已得到了验证，通过在哺乳动物的单拷贝基因座上鉴定出上百个直系同源基因座。一些鱼类被认为额外进行了一轮基因组的复制(4r)。例如吸口鲤科鱼类，大马哈鱼，鲤鱼和金鱼。最近的分子研究也证实了在鲤鱼和鲑科鱼类中的4r基因组复制理论。在大马哈鱼中，至少发现了13个hox基因簇，而在典型的3r硬骨鱼类中只有7-8个基因簇。 TLR7基因在遗传易感小鼠株中的复制被证实与系统性自身免疫的诱导有关

相关。所以，在基因组中维持某个tlr基因的两个拷贝数只有在两种形式都发挥不同的作用来避免tlr过量表达时才有意义。

在斑马鱼、虹鳟鱼和鲤鱼中发现了同源或重复的TLR4和tlr8基因。TLR信号转导分子MyD88和TRAF6也在鲤鱼体内重复。进化分析表明，斑马鱼的两个tlr8基因（tlr8a和tlr8b）可能是由R3基因复制产生的。然而，鲑鱼鳟鱼的两个tlr8基因似乎是drtlr8a的同源基因，由鲑鱼特有的R4事件产生。无论基因复制的进化史如何，我们都应该注意定量PCR和类似重复基因表达实验的设计。这在鲑鱼或鲤鱼等鱼类中尤其重要，因为它们目前缺乏高质量的基因组序列草图，并且经历了最近的（4R）基因组复制事件。因此，在设计定量引物检测这些多拷贝基因的差异表达时，我们应该选择在它们的差异区域设计引物，以便分别扩增这些不同的同源物。实验证明，精心设计的定量基因表达实验足够灵敏，可以检测tlr8a1和tlr8a2在虹鳟中的差异表达，以及myd88a和B或traf6a和B在鲤鱼中的差异表达。


鱼类特有的tlr家族包括tlr19、20、21、22和23。虽然在系统进化分析中它们与小鼠tlr11、12和13在一个分支上，但是它们也形成不同的分支。然而，对鱼类tlrs的进化史的更好的理解只能通过进行基因组分析和配体特异性实验来实现，并且要具体问题具体分析，类似于最近完成的斑马鱼tlr4b的研究。大多数鱼类特有的tlr的功能还不清楚。基因复制在鱼类特有的tlr家族的进化中似乎扮演着重要的角色。

鱼类TLR的主要特征和信号级联中的因素在结构上与哺乳动物TLR系统非常相似。然而，鱼类的TLR也表现出非常不同的特征和多样性，这可能是因为它们进化历史的多样性和生活环境的不同。随着基因组研究技术的出现，鱼类TLR已被大量发现，但对每种TLR在每种鱼类或类似鱼类中的实际作用的研究才刚刚开始。在鱼类中发现的至少16个TLR中，仅在TLR2、TLR3、tlr5m、tlr5s和tlr22中发现了配体特异性的直接证据。目前和不久的将来，鱼类TLRs研究的主要任务是开展特异性实验，以鉴定所有鱼类TLRs配体，这将促进比较免疫学的研究，并在了解鱼类的抗病机制、开发新的佐剂和/或更有效的疫苗和疗法方面发挥重要作用。

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