DNA提取方法

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DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany)试剂盒中文操作说明书 作者: Allanflying (站内联系TA) 发布: 2012-09-11

一.利用DNeasy® Blood & Tissue试剂盒提取样本总DNA 1.前处理: 注意:

1 石蜡包埋组织的DNA一般小于650bp,还要视样本类型与保存年限而定。 2 固定剂一般为福尔马林或酒精。不推荐用蛾酸固定的样本。 3 溶解时间随样本类型和溶解状态而定。 4 产量视样本类型和保存年限而定。推荐用50-100ulAE缓冲液洗脱纯化的DNA 5 开始前要预热孵化器或水浴锅至37℃,用于操作步骤9 1.石蜡包埋组织的前处理 操作步骤:

1 将小片石蜡包埋的组织(小于25mg)放入2ml离心管中(自备) 2 加入1200ul的二甲苯,用力涡旋震荡。 3 最大转速室温(15-25°)离心5分钟。 4 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。

5 往沉淀中加1200ul的(96-100%)酒精(目的是洗去剩余二甲苯),轻柔地震荡。 6 最大转速室温(15-25°)离心5分钟。 7 移液枪吸去上清。小心不要吸去沉淀。 8 重复一次步骤5-7

9 37°孵育10-15分钟,孵育过程打开离心管盖,直到酒精蒸发干净。 10 加入180ulATL缓冲液,继续提取组织总DNA中的步骤2 2.福尔马林组织的前处理 操作步骤:

1 PBS润洗组织样本(小于25mg)两次(目的是去除固定剂) 2 PBS,继续提取组织总DNA中的步骤1. 2动物组织总DNA的提取 注意:

1 ATL缓冲液和AL缓冲液可能存储后沉淀,如果沉淀,在56°孵育直至沉淀溶解。 2 AW1缓冲液和AW2缓冲液中加入一定量(见瓶身)的(96%-100%)酒精,然后才使用。

3 打开水浴锅至56℃,用于步骤2

4 如果是冻存的样本,拿出来室温预热,避免反复冻融。 操作步骤:

1 25mg组织,切成小块,放入1.5ml的离心管中。加入180ulBuffer ATL 2 加入20ul的蛋白酶K。涡旋震荡(5-10S56℃孵育直至组织消化完全,一般为1-3小时。偶尔间断的拿出震荡。

3 涡旋震荡15S加入200ulBuffer AL,涡旋充分混匀。加入200ul96%-100%的酒精。涡旋充分混匀。(注:样多时可将AL和酒精预混以节省时间) 4 转移步骤3中的所有混合液至DNeasy Mini spin离心柱,柱子放在2ml的收集管上(已提供),≧6000g8000rpm)离心1分钟。弃收集管/液。

5 将离心柱放在一个新的2ml收集管上(已提供)加500ul缓冲液AW1,≧6000g8000rpm)离心1分钟。弃收集管/液。

6 将离心柱放在一个新的2ml收集管上(已提供)。加500ul缓冲液AW220000g


14000rpm)离心3分钟。弃收集管/液。

7 将离心柱放在一个新的1.52ml离心管(自备)上,吸200ul的缓冲液AE在吸附膜上,室温1分钟,≧6000g8000rpm)离心1分钟。

8 为增大DNA产量,重复步骤7(注意:从离心管中吸取液体反复洗脱) 3动物血液或细胞中提取DNA

1 50-100ul的抗凝血至1.5ml2ml离心管中(自备),加20ul蛋白酶K,用PBS补加220ul

2) 加入200ul缓冲液AL,涡旋震荡充分混匀,56℃孵育10min 3)加入200ul的(96%-100%)酒精,涡旋震荡充分混匀。 4移取步骤3的混合液至离心柱上,离心柱放在2ml收集管上(已提供)6000g8000rpm离心1分钟。弃收集管/液。

5离心柱放至新的2ml收集管上(已提供)500ul的缓冲液AW16000g8000rpm离心1分钟。弃收集管/液。

6离心柱放至新的2ml收集管上(已提供)500ul的缓冲液AW220000g14000rpm离心3分钟。弃收集管/液。 7将离心柱放在一个新的1.52ml收集管(自备)上,200ul的缓冲液AE在吸附膜上,室温1分钟,≧6000g8000rpm)离心1分钟。

8)为增大DNA产量,重复步骤7(注意:从离心管中吸取液体反复洗脱)


本文来源:https://www.wddqxz.cn/7ee91b83f242336c1fb95eb4.html

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