鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究

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鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作

用研究

海水养殖鱼类经常被病原微生物所感染,导致产量下降,给水产养殖业带来巨大的经济损失。目前鱼类病害防治仍没有有效的措施,原因之一是病原的致病机制和宿主的免疫防御机制尚未完全阐明。

本文从病原和宿主免疫两方面入手,研究了鱼类常见病原菌荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)的致病机制和鱼类宿主半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)免疫因子(杀菌/通透性增强蛋白BPI和B型甘露糖结合凝集素BML)的抗细菌感染功能。本文通过蛋白质组学技术,首先比较了在正常和缺铁培养环境中荧光假单胞菌TSS全菌蛋白的差异表达情况。

在蛋白表达谱中发现了22个具有显著性差异表达的蛋白,通过查阅文献和结构分析,选取了其中四个,即Hem O(血红素加氧酶)、PspB(丝氨酸蛋白酶)、Sod(超氧化物歧化酶)和TfeR(Ton B依赖型外膜受体),分别构建了基因突变株,即TSS(35)hemO、TSS(35)pspB、TSS(35)sod和TSS(35)tfeR并进行了功能研究。实验表明,与野生株TSS相比,TSS(35)hemO、TSS(35)pspB和TSS(35)tfeR在组织侵染、致死率和抗宿主血清杀伤等方面的能力都显著降低,表明pspB、hemO和tfeR是参与感染的毒力基因;对宿主的免疫保护实验结果显示,当重组的TfeR和PspB以亚单位疫苗的形式免疫鱼类宿主后,宿主对于TSS的侵染产生了显著的免疫保护效应;抗体阻断实验表明,抗TfeR的抗体抑制了荧光假单胞菌TSS对宿主细胞的侵染。

这些结果表明,环境中铁的含量会影响荧光假单胞菌大量蛋白的表达发生变化,其中包括一些重要的毒力因子。利用蛋白质组学技术,比较了在正常和缺铁培


养条件下荧光假单胞菌TSS外分泌蛋白的差异表达情况。

在外分泌蛋白表达谱中,发现了15个具有显著性差异表达的蛋白,选取了一个差异蛋白——丝状血凝素(FHA),构建了编码该蛋白的基因突变株TSSfha,比较分析了突变株与野生株在毒力及生理方面的差异。体外实验表明,相较于野生株TSS,突变株(1)生长速度基本没有改变,但生物膜的形成能力和产生胞外丝状物的能力显著下降;(2)鞭毛受到破坏,运动性下降;(3)粘附宿主细胞的能力和自凝集能力显著下降;(4)凝血能力和抗宿主血清杀伤的能力显著下降。

体内感染实验表明,突变株感染宿主组织的能力显著降低,对宿主的致死率下降;抗体阻断天然FHA后,野生株TSS感染能力降低。此外,免疫保护实验表明,重组FHA免疫大菱鲆后可以显著提高大菱鲆抵抗TSS侵染的能力。

这些结果表明了荧光假单胞菌FHA是一个关键的毒力因子,并且在与致病相关的生理过程中发挥重要作用。以荧光假单胞菌的鱼类宿主半滑舌鳎为研究对象,探究了其两个免疫因子在抵抗荧光假单胞菌侵染过程中所发挥的作用。

杀菌/通透性增加蛋白(BPI)是先天免疫中一个重要分子,在哺乳动物中可以清除入侵的革兰氏阴性菌。在硬骨鱼中,BPI的功能还未可知。

因此,在本论文中,我们研究了半滑舌鳎BPI(CsBPI)在抵抗荧光假单胞菌等病原感染方面所发挥的生物学功能。蛋白定位结果表明,CsBPI可以被半滑舌鳎外周血白细胞分泌到细胞外环境中。

重组CsBPI(rCsBPI)能够结合荧光假单胞菌等革兰氏阴性菌,且对荧光假单胞菌的结合力最强,但不能结合革兰氏阳性菌;rCsBPI通过与荧光假单胞菌的结合,进而增强其细胞膜的通透性,破坏其结构最终导致细菌死亡,并且与rCsBPI结合的荧光假单胞菌更容易被外周血白细胞吞噬。体内实验表明,rCsBPI上调一

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