朊病毒的检测方法

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朊病毒的检测方法

朊病毒作为传染性海绵状脑病(TSE)的病原体，是TSE的诊断标志物，与组织病理学损伤(海绵状变性)相比，不仅出现的时间非常早，而且分布也十分广泛。因此，检测朊病毒对 ISE的早期鉴测、分类鉴别、最终确诊、监测控制以及对朊病毒致病机制的探索、研究，有着极其重要的意义。 1 动物传递实验

动物实验是判断生物体是否感染朊病毒、测定感染滴度、研究朊病毒传染性的主要手段。随着检测技术的进步，现在动物实验的许多功能已被更快捷、更准确的方法所代替，但作为生物学方法仍然是研究朊病毒不可缺少的重要环节。目前，已知的朊病毒病大多已建立了动物感染模型，小鼠、大鼠和仓鼠是最常用的朊病毒实验动物。

常规方法是将无菌的组织标本，用Teflon研棒匀浆后作10倍连续稀释，每个稀释度通常脑内接种6只小鼠(10～30μl)、大鼠(30μl)或仓鼠(50μl)。接种动物每3天检查1次，发现其出现毛乱、弓背、运动过慢和后肢瘫痪等病状后逐日检查，濒死扑杀，取脑组织作病理学检查，以验证朊病毒感染。如接种动物不发病，则继续观察至其死亡或适时盲传，最后取脑组织作病理学检查。根据动物发病和死亡数计算滴度。该方法的优点是比较敏感，是研究朊病毒生物学特性的重要实验。其缺点是费时、费力，滴定误差大，需消耗大量动物，费用昂贵。由于种属屏障和毒株、动物个体差异等因素的影响，传递的成功率往往相差较大，个别 GSS毒株的动物传递始终未获成功。因此，实验阴性并不能排除朊病毒感染，使用转基因动物是一条经济实用的削弱或消除种属屏障的实验途径，可明显改善传递效果。 2 免疫学方法

免疫学检测方法由于其灵敏度高，特异性强，方法众多，能适合不同检验要求的需要，目前已成为检测朊病毒的最主要方法。

(1)组织印迹：组织印迹技术是将灵敏的蛋白检测技术和解剖学组织保存技术结合起来，用于检测组织中微量的PrPsc。其灵敏度较高，甚至可以超过一般的免疫印迹，已被广泛地用于朊病毒的研究。

(2)斑点印迹：1990年，Serban等介绍了一种用硫氰酸胍处理的斑点印迹方法，将组织标本置于冷的裂解缓冲液中匀浆，然后500r/min离心5 min，去除不溶性残渣，上清液与含SDS样本缓冲液等量混合，吸取4μl混合液，点样于干的NC膜上，空气中干燥,iK消化，3mol/L硫氰酸胍处理，封闭后，进行免疫学检测。斑点印迹法灵敏度较低，但操作简便，对仪器设备要求低，适用大批量标本的筛查，易于普及推广。

(3)免疫印迹：由于使用了凝胶电泳分离技术和免疫检测技术，除了可以鉴定标本中特定的组分外，还能显示其电泳分离图谱，运用价值较高。免疫印迹技术简便、快速，对仪器设备要求低，而且不受组织自溶的影响，能在组织病理学结果阴性或含糊的情况下检出PrPres，具有早期确诊价值。目前，已成为朊病毒研究中最常用的检测方法之一。其基本步骤是：将待检组织标本匀浆、离心、蛋白酶K消化等一系列处理后，在12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，随后将蛋白质转印至NC膜或PVDF膜上，封闭，用特异性抗体进行免疫学检测。 (4)免疫组化：免疫组化是利用特异性抗体直接显示组织切片上致病性PrP。由于可以对PrPres的沉积进行精确的解剖学定位，为临床病理学诊断提供客观依据，因此，具有很高的临床诊断价值。免疫组化可以检测甲醛固定、石蜡包埋的组织标本，应用面较广。其基本步骤是：将甲醛固定或石蜡包埋的组织标本经一系列预处理后，依次与特异性抗体和酶标记第二抗体反应，最后加底物显色，显微镜下观察。


(5)酶联免疫吸附实验：该方法具有灵敏、特异、简便、快速、可定量、自动化等特点，非常适合大批量标本的普查筛选工作。目前报道的用于检测朊病毒的ELISA方法有两种：一种是间接法，即先将从各个标本中提取的PrPres分别包被于酶标板的孔中；另一种是双抗体夹心法，即先用特异性抗体包被酶标板，再加入标本提取物，37℃孵育。此后两种方法都依次加入特异性1抗、酶标2抗，最后加底物显色，酶标仪读板。

(6)关于免疫学检测中标本预处理的几点说明：①适当的标本预处理，可以暴露PrPres原先隐蔽的抗原表位和(或)修复被福尔马林破坏的抗原表位，提高PrPres的免疫反应性，有利于实验灵敏度的提高。②预处理并不是万能的，多种预处理都有失败的事例，预处理的效果可能取决于预处理暴露或修复的抗原表位能否被实验使用的抗体所识别。③某些预处理(如高压蒸汽处理法)可同时增加PrPsen的免疫反应性，但这对PrPsen的检测帮助不大，Yokoyama认为这仅仅是由于PrPsen表达太低造成的。④某些实验使用的抗体不能分辨 PrPres和PrPsen，又没有用PK消化以去除PrPsen，这些实验采用预处理的目的主要是利用 PrPres和PrPsen对预处理反应的差异，筛选预处理条件，尽量增强所用抗体与PrPres的免疫反应性，抑制与PrPsen的免疫反应性，扩大二者实验结果的差异，以达到筛查患感染TSE生物体的目的。⑤不进行标本预处理，单靠选用改良的抗体，同样可以提高试验的灵敏度。 3 借助特殊仪器的检测方法

(1)电镜法：电镜检测瘙痒病相关纤维(SAF)是朊病毒检测的另外一种方法。现在认为PrPsc是SAF的组成成分。瘙痒病相关纤维为杆状、纤维状结构，其实是PrPsc在用去垢剂提取过程中，不同提取条件下形成的产物，感染生物体的组织切片中尚未发现SAF。基本步骤是：将被检组织置于10％N-laruoylsarcosine溶液中匀浆，差速离心、PK消化，重悬于蒸馏水中，负染，电镜观察。镜下可见两种瘙痒病特有的大分子纤维。电镜检查SAF灵敏度较低，不如免疫印迹方法。

(2)毛细管SDS-凝胶电泳：该法主要是通过理化方法--差速、超速离心，sodium N-lauroylsarcosine、PK处理，提纯PrPsc，然后在 Beckman P/ACE 5 500上进行毛细管SDS-凝胶电泳。根据各组分通过检测器时，在214 nm波长处产生吸收峰的时间和峰形，鉴别出瘙痒病病原因子PrPsc。该法标本用量少，无需免疫学试剂，判断直观；缺点是需用超速离心机、专用毛细管电泳仪。

(3)荧光标记肽链的毛细管电泳免疫测定法：该法是根据免疫竞争原理测定，采用无区带毛细管电泳技术结合免疫荧光技术，检测标本中微量的PrPse。其基本原理是将人工合成PrPsc特异性肽链(142～154)标记上荧光，然后与一定量的特异性抗体、羊脑提取物一起电泳，荧光标记的肽链与抗体结合后，迁移率发生改变，从而与游离的标记肽链分离开来，由于抗体的量只能结合大约50％的标记肽链，因而荧光标记的结合型肽链与游离型标记肽链的比例是固定的。当羊脑提取物中存在微量的PrPsc，由于其与标记肽链竞争结合抗体，导致结合型肽链与游离型肽链的比例发生改变，从而被仪器检测出来。该方法灵敏度很高，能检测到135 pg的PrPsc，可用于检测朊病毒水平很低的脑外组织(如血液等)。

(4)双色强荧光目标扫描法：该法是运用共聚焦双色荧光相关分光镜技术检测极其微量的朊病毒。其基本原理是利用致病性 PrPres，在适当条件下自我复制和自发聚集的特点，将重组PrP(rPrP)标记上绿色荧光，PrPres与正常构象的rPrP结合后，通过变构复制出大量的异常构象的rPrP盖。由于PrPres在一定条件下可自发聚集，从而使PrPres周围聚集了大量的rPrP盖，使其荧光强度超过游离的rPrP50倍。同时为了增强实验的特异性，又加入了标记上红色荧光的特异性单抗，使PrPres- rPrP盖聚集体又标记上红色荧光。只有同时发出高强度红、绿荧光的颗粒，才能被检测仪器判为PrPres。

目前，朊病毒领域的许多方面对人类来说还有一片空白或知之甚少，如朊病毒突破种属屏障传播的程度，通过生物制品和临床医疗传播的危险性，其他传播途径的探知，以及朊病毒致病机制的研究等等，诸多方面的问题都离不开朊病毒的检测，朊病毒检测方法的发展必将为朊病毒的研究开辟广泛的前景。


参 考 文 献

[1] 赵德明,杨建民,刘美丽,尹晓敏,马李颖,周向梅.一种牛朊病毒抗体及其制备方法.申请人:中国农业大学,中华人民共和国国家知识产权局 2005年.

[2] 孙宪锋,董小平,张宝云,周伟,王长安,赵同兴,洪涛,人朊病毒多肽抗体的制备及应用 中华医学会 中华微生物学和免疫学杂志 2000年 第1期.

[3] 张磊,李宁.朊病毒疾病的诊断技术期刊-核心期刊 生物技术通报.2001年,第05期.

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