DNS比色法测定还原糖和总糖

【#文档大全网# 导语】以下是®文档大全网的小编为您整理的《DNS比色法测定还原糖和总糖》，欢迎阅读！

乳粉中还原糖的测定

(3,5-二硝基水杨酸比色法)

一、实验目的

1、掌握还原糖和总糖测定的基本原理

2、学习比色法测定还原糖的操作方法和分光光度计的使用

二、实验原理

还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。

还原糖是指含有自由醛基或酮基的糖类。单糖都是还原糖，双糖和多糖不一定是还原糖，例如乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用各种糖的溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来。对非还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成还原性单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量(常以葡萄糖含量计)。

还原糖在碱性条件下加热可被氧化成糖酸及其它产物，而氧化剂3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以系数0.9。

三、实验材料和试剂

1、实验材料 乳粉 2、实验试剂

① 1mg/ml葡萄糖标准液

准确称取95℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，混匀，4℃冰箱中保存备用。 ② 3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂

将6.3g DNS和262ml 2M NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

③乙酸锌溶液：称取21.9g乙酸锌，加3mL冰乙酸，加水溶解并稀释至100mL。④亚铁氰化钾溶液：称取10.6g亚铁氰化钾，加水溶解并稀释至100mL。

四、实验器材

比色管：25ml×9 烧杯：100ml×1


容量瓶：100ml×3 刻度吸管：1ml×1；5ml×2；10ml×1 恒温水浴锅 天平 分光光度计

五、操作步骤

1、制作葡萄糖标准曲线

取7支比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/ml的葡萄糖标准液、蒸馏水和DNS试剂，配成不同浓度的葡萄糖反应液。

1mg/ml葡萄糖

标准液(ml)

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2

表1 葡萄糖标准曲线制作

蒸馏水 葡萄糖含量 光密度值 DNS (ml) (ml) (mg) (OD-540nm)

2 1.5 0

1.8 1.5 0.2

1.6 1.5 0.4

1.4 1.5 0.6

1.2 1.5 0.8

1.0 1.5 1.0

0.8 1.5 1.2

管 号 0

1 2 3 4 5 6

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min取出，冷却至室温，用蒸馏水补足至10ml，加塞后混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，分别测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量(mg)为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。 2、样品中还原糖的测定 ① 还原糖的提取

称取0.5-2.0g样品，放入100ml烧杯中，先用少量蒸馏水溶解，无损转移到100ml容量瓶中，加5ml乙酸锌溶液及5ml亚铁氢化钾溶液，定容至刻度，摇匀。静置30min，过滤，滤液备用。 ②显色和比色

取2支比色管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。

表2 样品还原糖测定

管 号 7 8

还原糖待测液 （mL） 0.5 0.5

蒸馏水 （mL） 1.5 1.5

DNS （mL） 1.5 1.5



光密度值 （OD-540nm） 查曲线葡萄糖量（mg）



五、结果与计算

计算出7、8号管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计


算出样品中还原糖和总糖的百分含量。

查曲线所得葡萄糖毫克数×提取液总体积/测定时取用体积

还原糖(%) =——————————————————————————×100

样品毫克数

六、注意

1. 离心时对称位置的离心管必须配平

2. 标准曲线制作与样品测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点比色

3. 若比色液颜色过深，其吸光度可能超出标准曲线浓度范围，可将样液适当稀释后再显色测定

[思考题]

1、3,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?

2、如何正确绘制和使用标准曲线?

DNS试剂的相关介绍：

酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，262ml 2M NaOH溶液(20.96g NaOH溶解于262ml蒸馏水)，苯酚5g，无水亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，室温保存，室温下存放7天后使用，有效期为6个月。

但是一定要注意，3，5-二硝基水杨酸和NaOH的加入时间一定要很近，或者是先加入NaOH。否则会产生难溶的沉淀，导致配制溶液失败。且配置过程中，溶液加热温度不宜超过50摄氏度。

本文来源：https://www.wddqxz.cn/1d80411e64ec102de2bd960590c69ec3d4bbdb59.html