关于RNA提取的一些问题

2023-11-12 12:28:24   文档大全网     [ 字体: ] [ 阅读: ]

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关于RNA提取的一些问题

问题1 RNA提取的时候怎么样有效的避免DNA的污染? 2 RNA提取后在-20放置,可保存多久? 3 大家用的trizol是自己配的还是买的?

答案一1、在提取过程增加DNase消化步骤。除使用酶消化外的方法去DNA都不是很彻底。视后续实验而定。 2如有条件最好放-80保存。主要担心是如果提得不纯(有杂质或未完全灭活的RNase-20度保存过程中降解。且这个保存时间跟物种、提取方法等有关。尝试过有些物种的RNA-20度保存一个月后出现降解的情况(未知是提得不纯或物种原因)

3、实验要求不高可以自己配点Trizol来提,如果重要的实验建议还是购买invitrogen的。

答案二:我之前提取过RNA,鼠肺组织的,关键是避免污染,所用TRIZOL买的是天根试剂公司的,感觉还可以,当然跟你的提取方法还有所用材料有关。提完最好放-80保存,可以存放久一点。至于用DNA酶处理我没有使用,提取质量还可以。

答案三、在提取RNA时最好所用的所有器械都要经过DEPC水过夜处理,实验平台和仪器不能和做NDA的混用,最好要有专用的RNA操作实验平台

答案四、动作要快,避免空气中,皮肤中以及呼吸中的RNA酶。加氯仿时应充分震荡使其充分乳化。组织样品应保持新鲜。RNA样品长时间反复使用可以-20保存,但是易降解。建议分装小管后保存-80Trizol试剂购自Takara公司

答案五、我们实验室一般都是把提取的RNA逆转成cDNA后,在放在-80°C,这样可以保存的久一点;TrizolTakara公司的。

答案六、同意5楼观点,逆转录成cDNA再保存方便一点,有条件的话当然是买现成的,RNA酶处理过的枪头,trizol的话目的有二,一是抑制RNA酶的活性,二是使蛋白质变性溶解,里面成分的量会对效果有影响,而且既然是能使蛋白变性的东西,对人体也是有毒的,所以能买尽量买吧。

答案七1.RNA提取注意事项很多,但都是一个目的:放置降解和杂质干扰,特别是降解。相关仪器DEPC处理自不必说,还有操作台面以及移液器的75%乙醇擦拭、研钵的180度处理,再就是操作者的口罩手套防护,操作过程的低温保持等等。

2. 提取的RNA我从来不放到-20度,除非几分钟之后马上进行下面的操作,避免反复冻融。倒是有一次一个同学勿放到-20度约一个月,基本不能用了。 3. Trizol都是买的,一直用的宝生物,好像很可以。

答案八、我们提RNA时用的离心管都是买的经过DEPC睡处理后无RNA酶的,在生物通风柜中戴口罩手套进行操作,trizol是买的Takara公司的。RNA提取出来后一般都不直接这样子保存在-20,都是反转录成cDNA后保存在-80里的。

答案八、Takara公司的Trizol就没问题,按步骤提取即可,液氮速冻存于-80℃。所有用具需用depc水处理。多操作几次就好了,没必要着急。 TRIZOL法提取RNA的具体步骤:

1、在提取组织RNA时,每50100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解;提取细胞RNA时,先离心沉淀细胞,每5-10106个细胞加1ml Trizol后,反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。

2、将组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟;在EP管中,按照每1mlTRIZOL0.2ml氯仿的量加入氯仿,盖上EP管盖子,在手中用力震荡15秒,在室温下(15℃~30℃)放置23分钟后,12000g2℃~8℃)离心15分钟。


3、取上层水相置于新EP管中,按照每1mlTRIZOL0.5ml异丙醇的量加入异丙醇,在室温下(15℃~30℃)放置10分钟,12000g2℃~8℃)离心10分钟。

4、按照每1mlTRIZOL1ml 75%乙醇进行洗涤,涡旋混合,7500g2℃~8℃)离心5钟,弃上清;让沉淀的RNA在室温下自然干燥;用Rnase-free water溶解RNA沉淀。 Ps:在收集到生物材料之后,最好马上进行RNA制备工作。若需暂时储存,则应以液氮生物材料急速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时,将储存于冷冻柜的材料取出,立即以加入液氮研磨的方式打破细胞,不可以先行解冻,以避免RNase的作用。



想请教用过Trizol法提取RNA,且结果比较理想的详细步骤及注意事项,是否可以共享一下?

我这边刚好在做,给你说下:

贴壁细胞的话去培养液,PBS洗一遍,加Trizol吹打下来。组织的话,在液氮里面捣碎,然后粉末放进Trizol,用超声粉碎器粉碎(超声每3秒,停10秒冷却,直到看不见组织碎末) (此步骤可以-80oC冻存,下面可以以后再做)

1毫升Trizol200微升氯仿(氯仿需饱和,可以在氯仿加一两公分高的水层,摇晃后静置分层,用时到下层取氯仿)

使出吃奶的劲把Trizol氯仿混合液摇成浑浊的乳液,每个样起码狂摇30(用手拿着,不能用漩涡混匀器)

静置3分钟,分层,进4度离心机,1400015-30分钟。

取上层无色清澈液体,进新管。枪尖绝对不能贴壁,绝对不能碰触到极薄的乳白固态中间层,绝对不能吸到下层的红色液体。假定是1毫升Trizol200微升氯仿的量,你这里取个400-500微升就可以偷笑了,千万别贪心,造成污染。 加相等体积异丙醇,倒置数次混匀,不用太激烈。 (次步骤又可以-80oC冻存,下面可以以后再做)

4度离心机,1400010分钟,这个时候可以看见小沉淀物了,白色,看不见的话,产量就悲剧了。

弃上清,用1毫升75%酒精洗两次(加酒精,手摇看到沉淀物游来游去就可以了,然后离心弃上清)酒精尽量吸干净,但枪尖不要碰到沉淀物。

盖子打开,在通风橱里面晾干(一般5-10分钟。看到沉淀物从白色变半透明就赶快停了,干过头了等下难以溶解)

加干净的水(没有核酸酶的,你懂的)10-50微升依你产量而定啦。55oC水浴5-10分钟充分溶解。

大功告成,可以测浓度和各项指标,分装,冻存了。

如果需要用DNAseDNA,加在异丙醇步骤前即可。


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