生化实验-ELISA-清华

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现代生物学导论-生化实验报告-ELISA

生医9 田雪霏 2009013189 （同组人：于淼）



一、 实验名称：酶联免疫吸附测定 二、 实验原理：

ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA） 。基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。 此次实验采用间接法，是检测抗体最常用的方法。

这一方法的基本原理是：①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

三、 实验仪器和材料：

1. 聚苯乙烯微量细胞培养板(平板, 96孔)。 2. 酶联免疫检测仪

3. 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。 4. 包被液：

0.05 mol/L 碳酸缓冲液（pH 9.6）： Na2CO3 0.15克, NaHCO3 0.293克，

蒸馏水稀释至100 毫升。 5. 稀释液（PBS-Tween）： NaCl 8克, KCl 0.2克， KH2PO4 0.2克,

Na2HPO4·12H2O 2.9g, Tween-20，0.5毫升， 蒸馏水加至1000毫升。 6. 洗涤液：同稀释液。

7. 封闭液：0.5 % （质量分数）BSA（用PBS配制）。 8. 邻苯二胺溶液(底物)：

0.1 mol/L 柠檬酸 (2.1克/100毫升), 取6.1毫升，

0.2 mol/L Na2HPO4·12H2O (7.163克/100毫升), 取6.4毫升, 加蒸馏水12.5毫升,


取邻苯二胺8毫克（溶解）；

临用前加30 % （体积分数）H2O2 40 微升。 9. 终止液：2 mol/L H2SO4。

四、实验步骤

1．包被抗原： 用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10微克/孔，

每孔加200微升, 37 ℃温育半小时。

2．洗涤：倒尽板孔中液体，加200微升洗涤液，反复三次，最后将反

应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 3．加封闭液200微升，37 ℃温育半小时。 4．洗涤同2。

5．加被检血清： 用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200微升。

同时作稀释液对照。37 ℃温育一小时。 6．洗涤同2。 7．加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 37 ℃温育半小时。 8．洗涤同2。

9．加底物：邻苯二胺溶液加200微升，室温暗处5分钟。 10．加终止液：每孔50微升。

11．观察结果：用酶联免疫检测仪记录OD490nm读数。

五、实验结果

实验数据： 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 B 0.254 0.551 0.398 0.255 0.150 0.093 0.062 0.023 0.004 0.004 C 0.197 0.462 0.430 0.285 0.146 0.102 0.058 0.033 0.004 0.003 D 0.570 0.288 0.416 0.310 0.140 0.111 0.083 0.053 0.004 0.003

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