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DNA提取过程中各种试剂的作用及原理1-溶液I—溶菌液：溶菌酶：它是糖 昔水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的B-1,4糖昔键，因而 真总溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。葡萄糖：增加 溶液的粘度，维持渗透压'防止DNA受机械剪切力作用而降解。
EDTA： （1）螯合Mg2+. Ca2+等金属离子，拗制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解 作用（DNase作用时需要一定的金属离子作舷）；（2） EDTA的存在，有利于 溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。 2. 溶液 II-NaOH-SDS 液：
NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中，是稳定的。
但当pH>12或pH〈3时，就会引起双链之间氢鍵的郴而变性。
在溶液II中的NaOH浓度为0. 2mol /L,加抽提液时，该系统的pH就高达 12.6,因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。
SDS： SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：
（1） 溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。 （2） 解趣胞中的核蛋白。
（3） SDS能与蛋白质结合成为RP-S03-…R+-蛋白质的复合物，蟆蛋白质变性 磁旋下来。
但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除 干净，防止在下一步操作中
（用RNase去除RNA时）受到干扰。
3. 溶液HI—3mol/L NaAc （pH4.8）溶液：NaAc的水溶液呈碱性，为了调节 pH至4.8,必须加入大量的冰醋酸。
所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4. 8的NaAc溶液是为了把pH12. 6 的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而髙 盐的3mol / L NaAc有利于变 性的大分子染色体DNA、
RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少 相斥力而互相聚合，
后者是因为钠盐与SDS—蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使 沉淀更完全。
4・为什么用无水乙醇沉淀DNA?
用无水乙醇沉淀DNA,这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可 以任意比和水相混溶.
乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水 分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA 相混合，其乙醇的最终含量占67%左右。
因而也可改用95%乙醇来替代无水乙醇（因为无水乙醇的价格远远比95%乙醇 昂贵）o
但是加95%的乙醇使总体积增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而 DNA损失也增大，
尤其用多次乙醇沉淀时，就会影响收得率。折中的做法是初次沉淀DNA时可用 95%乙醇代替无水乙酵，最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用0. 6倍体 积的异丙醇选择性沉淀DNAo 一般在室温下放置15-30分钟即可。
5. 在用乙醇沉淀DNA时，为什么一定要加NaAc或NaCl至最终浓度达0.1〜 0. 25mol/L?在pH为8左右的溶液中，DNA分子是带负电荷的，加一定浓度的 NaAc或NaCl,使Na+中和DNA分子上的负电荷，
减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀，当 加入的盐溶液浓度太低时，
只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全，当加入的盐 溶液浓度太高时，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在， 影响DNA的酶切等反应， 必须要进行洗涤或重沉淀。
6. 加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用SDS与KAc来处理？加进去的 RNase本身是一种蛋白质，为了纯化DNA,又必须去除之，加SDS可使它们成为 SDS-蛋白复合物沉淀，再加KAc使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐形式的 SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。也可用饱和酚.氯仿抽提再沉 淀，去除 RNaseo在溶液中，有人以KAc代替NaAc,也可以收到较好效果。
7. 为什么在保存或抽提DNA过程中，一般采用TE缓冲液？在基因操作实验 中，选择缓冲液的主要原则是考虑DNA的稳定性及缓冲液成分不产生干扰作 用。磷酸盐缓冲系统(pKa=7. 2)和硼酸系统(pKa=9. 24)等虽然也都符合细 胞内环境的生理范围(pH),可作DNA的保存液.但在转化实验时，磷酸根离 子的种类及数量将与Ca2+产生Ca3 (P04) 2沉淀，在DNA反应时，不同的酶对 辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高离子浓度，有的则要求低 盐浓 度，采用Tris-HCl (pKa二&0)的缓冲系统，由于缓冲液是TrisH+/Tris,不存 在金属离子的干扰作用，故在提取或保存DNA时，大都釆用Tris-HCl系统，而 TE缓冲液中的EDTA更能稳定。 氯仿的作用主要是使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇的作用是 消除抽提过程中出现的泡沫。
氯仿是强蛋白质变性剂，抑制RNA酶的活性，除去蛋白质污染。
基因组DNA- CTAB法 CTAB 法原理(植物 DNA 提取经典方法)CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基漠化鞍)，是一种阳离子去污剂，具有从低离子强度溶 液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.在高离子强度的溶液中(>0・7inol/L NaCl) ,CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸•通过有机溶剂抽 提，去除蛋白，多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来.
注:CTAB溶液在低于15°C时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的植物材料 之前必须预热，且离心时温度不要低于15-C.
基因组DNA- CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方 Tris-HCl (pH8. 0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+ 离子，抑制DNase活性；
NaCl提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；B -蔬基乙醇是抗氧化剂,有效地 防止酚氧化成酿，避免褐变,使酚容易去除 基因组DNA- CTAB法
CTAB提取缓冲液的改进配方PVP （聚乙烯毗咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形 成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖 结合，有效去除多糖.基因组DNA的提取核酸分离，纯化采用吸附材料吸附的方式 分离DNA时,应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但 动作要轻柔离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在 提取过程中辅以相应的去杂质的方法基因组DNA的提取核酸分离，纯化 蛋白质 的去除:酚/氯仿抽提使用变性剂变性（SDS,异硫氤酸肌等）高盐洗涤蛋白酶处 理核酸分离，纯化
多糖的去除:高盐法:用乙醇沉淀时,在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl,高 盐可溶解多糖•用多糖水解酶将多糖降解•在提取缓冲液中加一定量的氯苯（1/2 体积），氯苯可以与多糖的轻基作用,从而去除多糖.用PEG8000代替乙醇沉 淀 DNA:在 500 UL DNA 液中加入 200 u 1 20% PEG8000 （含 1.2 M NaCl），冰浴 20min.核酸分离，纯化 多酚的去除:在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：B-藐 基乙醇，抗坏血酸，半 胱氨酸，二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂:如PVP （聚 乙烯毗咯酮）疋EG （聚 乙二醇），它们与酚类有较强的亲和力,可防止酚类与DNA 的结合 盐离子的去除:70%的乙醇洗涤核酸吸附，沉淀和溶解使用合适的吸附材料 吸附 核酸,其它的杂质均被洗掉，达到纯化DNA的目的另一种方式加入1/10体积 的NaAc （pH5. 2, 3M）,用预冷的乙醇或异丙醇沉淀RNA吸附或沉淀后应用70%的乙 ®洗涤，以除去盐离子等若长期储存建议使用TE缓冲液溶解TE中的EDTA能螯合 Mg2+或Mn2+离子，抑制DNasepH值为& 0,可防止DNA发生酸解。
基因组DNA提取常见问题
DNA中含有蛋白，多糖，多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解 反应DNA中残留有金属离子有RNA的存留原因对策重新纯化DNA,过吸附柱去除蛋 白,多糖,多酚等杂质重新沉淀DNA,让酒精充分挥发增加70%乙醇洗涤的次数（2- 3次）加入RNase降解RNA
问题一:DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应• DNA提取常见问题材料不新鲜或 反复冻融未很好抑制内源核酸酶的活性提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打 断 外源核酸酶污染反复冻融。尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融液氮 研 磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液在提取内源核酸酶含量丰富的 材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量，细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔所有 试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融 问题二:DNA降解.DNA提取常见问题实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分吸附 或沉淀不完全洗涤时DNA丢失。尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研 磨充分;G+菌，酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁•高温裂解时，时间适当延 长（对于动物细胞，细菌可增加PK的用量）•增加吸附的时间，或低温沉淀小心 操作问题三:DNA提取量少.
本文来源：https://www.wddqxz.cn/10325fed8aeb172ded630b1c59eef8c75fbf9512.html
2022-10-13
