嘌呤霉素筛选程序

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嘌呤霉素筛选程序

一、 杀伤曲线

1. 在24 孔板内接种细胞，约3x104/孔，共11孔，培养过夜。

2. 第二天，观察细胞密度为20%-30%。稀释嘌呤霉素 (0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 µg/ml)至培养基, 每孔加入0.75ml培养基。

3. 每隔2天观察细胞的存活情况（贴壁细胞飘起即为死亡，悬浮细胞，可以通过观察细胞的膜情况来判断，死亡细胞的细胞膜较为粗糙，有皱褶，没光泽，准确应以取少量细胞进行台盼蓝染色为准），每隔2天更换0.75ml含相应浓度嘌呤霉素的培养基。

4. 筛选4-7天内使细胞全部死亡的最低嘌呤霉素浓度，即为杀伤浓度（筛选浓度）；

二、 细胞筛选

1. 转染（24孔板进行）或电转后培养24小时，按10%密度传代（传至35mm平皿），继续培养24小时，待细胞密度增至20％～25％汇合时；

2. 去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度（杀伤曲线实验确定）配制好的嘌呤霉素筛选培养基2-3ml。

3. 根据培养基的颜色和细胞的存活情况，每隔2天更换一次筛选培养基 (培养基用量为2-4ml，细胞多，多加培养基，细胞少，少加培养基), 一般在3-4天内出现细胞大量或少量死亡情况（如果转染效率或电转效率高，则死亡少；如果转染效率或电转效率低，则死亡多；如果筛选浓度偏低，筛选培养基用量少，细胞密度大于80%，会导致大量假阳性克隆）。如果筛选第一周，出现细胞大量死亡，则在原培养皿中继续加入筛选培养基进行筛选一周；如果


筛选第一周，出现细胞少量死亡，则把细胞按10%密度传代（传至35mm平皿，传一个皿即可，多余细胞丢弃），利用筛选培养基进行筛选一周； 4. 筛选第二周结束后，则把细胞消化下来，进行终点稀释（10ul培养基中含1个细胞，用筛选培养基），把上述10ul细胞悬液加入96孔板中（提前加入40ul筛选培养基），一共加24孔，4小时后观察每个孔的情况，记录只含一个细胞的孔，含有一个细胞的孔用于继续筛选，其余孔舍弃；

5. 根据培养基的颜色和细胞生长情况换入新的筛选培养基，待细胞密度为80%时，将其传代至24孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至6孔板中增殖，待细胞密度为80%时，将其传代至T25瓶（一传3）中增殖, 每隔3天换液。

6. 细胞大量扩增后，一瓶用于提取总RNA进行QPCR检测，一瓶用于总蛋白进行WB检测，另一瓶用于保种，根据QPCR和WB结果取舍阳性克隆；

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